Na 25 dae van statiese inkubasie by 28°C het lakkase van *Pleurotus ostreatus* NRC620 die hoogste aktiwiteit in die swamkultuurmedium getoon. Die optimale pH- en temperatuurwaardes vir hierdie ensiem was onderskeidelik 3.0 en 70°C. Na 2 uur van inkubasie by 40°C en 50°C het die ensiemaktiwiteit onderskeidelik 68.33% en 59.61% behou. Na 2 uur van inkubasie in sitraat-fosfaatbuffer (pH 7.0) het die ensiemaktiwiteit op 100% gebly. Die byvoeging van 10 mM MgSO₄ en CuSO₄ het die ensiemaktiwiteit met onderskeidelik ongeveer 21% en 35% verhoog, terwyl NaCl, MnCl₂, KCl en CaCl₂ die ensiemaktiwiteit geïnhibeer het. Deur ABTS as 'n substraat te gebruik, was die kinetiese parameters (Km en Vmax) van *Pleurotus ostreatus* NRC 620 lakkase onderskeidelik 1.99 mM en 16,217 μmol min−1 L−1. Ensiematiese behandeling van appelsapmonsters het beide pH en viskositeit aansienlik verminder, en hierdie vermindering het gekorreleer met 'n toename in bergingstyd. Lakkasebehandeling het gelei tot 'n effense afname in die totale fenoliese inhoud van appelsap, maar geen vermindering in antioksidantaktiwiteit is waargeneem nie.
In onlangse jare het navorsers gefokus op die toepassing van groen biotegnologie in die voedselbedryf. Lakkase is een van die nuttigste ensieme in die voedselbedryf en vind toepassings in gebiede soos sapverwerking, bak, wynstabilisering en die verbetering van die organoleptiese eienskappe van voedselprodukte.1Baie hoër plante en mikroörganismes skei lakkase af,2en swamme soos deuteromycetes, ascomycetes en basidiomycetes kan ook lakkase produseer.3Lakkase (EC 1.10.3.2) is 'n blou oksidase wat molekulêre suurstof tot water reduseer deur 'n stelsel te gebruik wat uit drie verskillende koperatome bestaan, waardeur verskeie fenoliese verbindings en aromatiese amiene geoksideer word. Tydens die produksie van vrugte- en groentesappe is ensiematiese en nie-ensiematiese verbruining kritieke kwessies.4Aangesien hierdie stowwe die kleur, geur en aroma van die sap negatief beïnvloed, moet hulle verwyder word.5
Van alle vrugte word appels wêreldwyd en in die Europese Unie die meeste verbruik. In 2019 was appelproduksie wêreldwyd derde, met meer as 87 miljoen ton.6Appels bevat talle fenoliese verbindings, insluitend flavonoïede en fenoliese sure soos kafeïensuur en chlorogeniese suur.7Omdat appelsap tipies in sy helder vorm verbruik word, gaan ongeveer 50% tot 90% van die fenoliese komponente tydens die filtrasieproses verlore.8Vandag is verbruikers geneig om minimaal verwerkte produkte te kies, soos troebel appelsap met 'n hoë polifenolinhoud. As gevolg van die hoë fenoliese inhoud is hierdie tipe appelsap egter besonder vatbaar vir verkleuring en verdonkering.9Verskeie tegnologieë, insluitend hittebehandelingsmetodes soos pasteurisasie teen 60–90°C, word gebruik om die verdonkering van appelsap te verminder of te voorkom.10Volgens navorsing deur Sauceda-Gálvez11, termiese verwerking kan vlugtige chemikalieë vernietig en die organoleptiese eienskappe van appelsap beïnvloed. Alternatiewe vir termiese verwerkingsmetodes sluit in superkritiese koolstofdioksied, ultravioletstraling, ultraklank, hoë hidrostatiese druk of hoëdrukhomogenisering.12Die doeltreffendheid van hierdie tegnologieë en die opbrengs van geskikte vrugtesappe hang af van die parameters wat gebruik word en produkeienskappe. Hul wydverspreide gebruik word beperk deur hoë koste, nadelige gevolge vir die kwaliteit van sommige voedselprodukte, of onvoldoende ensieminaktivering.13,14
Lakkase kan gebruik word om vrugtesap te stabiliseer en te verhelder.15Gökmen et al.16beveel die gebruik van lakkase vir vrugtesapverheldering aan omdat dit fenoliese verbindings effektief verwyder deur hulle om te skakel in polimere of oligomere wat maklik deur enige ultrafiltrasiemembraan verwyder kan word, wat appelsap toelaat om stabiele kleur en helderheid vir tot ses weke by 50°C te behou. Gesuiwerde *Trichoderma* lakkase is op alumina-krale geïmmobiliseer en gebruik om selektief afsmaakverbindings wat veroorsaak word deur mikrobiese kontaminasie van appelsap, te verwyder.17
Ongeveer 80-90% van die vlugtige komponente van appelsap is esters en aldehiede, wat 'n unieke aroma aan die sap verleen.18Lakkase van *Trametes versicolor* is geïmmobiliseer op 'n goedkoop ondersteuning gemaak van natuurlike vesel van jong klapperdoppe vir appelsapverheldering.19Vorige studies het die stabilisering van appelsap (kleur en troebelheid) ondersoek deur gebruik te maak van ensiemvrye of immobilisasiemetodes, of in kombinasie met ultrafiltrasie.5,19Die effek van swamlakkases op die fisies-chemiese eienskappe van appelsap tydens berging bly egter onduidelik. Daarom was die doel van hierdie studie om eksperimenteel die veranderinge in die fisies-chemiese eienskappe, fenoliese verbindinginhoud en antioksidantaktiwiteit van appelsap te ondersoek na behandeling met swamlakkases en twee weke lange verkoelde berging. Lakkases het die vermoë om fenoliese verbindings te oksideer, wat hulle belowend maak vir gebruik in verskeie industriële prosesse, insluitend sapverheldering. Hierdie studie het lakkases van *Pleurotus ostreatus* NRC 620 ondersoek, met die fokus op die ideale toestande vir hul aktiwiteit en effektiwiteit in sapverheldering. Terwyl navorsing oor oestersampioene (P. ostreatus NRC 620) steeds beperk is, het vorige studies ensieme van verskeie swambronne, soos Trametes versicolor en Ganoderma lucidum, ondersoek. Die doel van hierdie studie was om die potensiële toepassing van hierdie ensiem in die voedselbedryf te evalueer en die unieke eienskappe daarvan uit te lig, veral die ideale pH en temperatuur.
2,2′-Azooksibis(3-etielbensotiasolien-6-sulfonsuur) (ABTS) is van Sigma-Aldrich (Kanada) aangekoop. Alle ander reagense was van analitiese graad.
Die Nasionale Navorsingsentrum se Mikrobiese Kultuurversamelingsentrum het die bekende oestersampioenstam NRC620 verkry. Na subkultuur is hierdie stam op aartappeldekstrose-agar-skuinsplate by 4°C gestoor. Die inokulumvoorbereidingsmetode was soos volg: 10 dae oue, volledig ontwikkelde miselium is op aartappeldekstrose-agarplate ingeënt en by 28°C geïnkubeer. Na 10 dae is drie miseliumblokke met 'n deursnee van 12 mm uit die agarmedia verwyder met behulp van 'n steriele metaalpons en in 250 ml Erlenmeyer-flesse met katoenproppe geplaas wat 50 ml gesteriliseerde kultuurmedium bevat (pH 5.0, soos voorheen deur Othman et al. beskryf).20Die kulture is vir 18 dae by 28°C geïnkubeer. Die kulture is toe deur Whatman No. 1-filterpapier gefiltreer, en die gevolglike supernatant het as die ensiembron gedien.
Lakkase-aktiwiteit is bepaal met behulp van ABTS as 'n substraat. Die reaksiemengsel (2 mL) het 500 μL van 0.3 mM ABTS (opgelos in 0.1 M natriumsitraatbuffer, pH 4.5) en die vereiste hoeveelheid ensiemmonster verdun met gedistilleerde water bevat.21,22Aangesien lakkase ABTS by kamertemperatuur (28 °C ± 2) kan oksideer, is ABTS-oksidasie bepaal deur die toename in absorbansie by 420 nm (ε420= 36 000 cm-1 M -1) met behulp van 'n Agilent Carry-100 UV-spektrofotometer. Een eenheid lakkase-aktiwiteit was nodig om 1 μmol ABTS per minuut te oksideer. Proteïenkonsentrasie is bepaal deur die Bradford-metode met behulp van beeserumalbumien as 'n interne kontrole.23,24
Nadat die ensiem van die oestersampioenstam NRC 620 verkry is, is die aktiwiteit daarvan met verskillende kweekintervalle vir 25 dae onder statiese toestande by 28 °C gemeet.
Om die effek van temperatuur op lakkase-aktiwiteit te bestudeer, is eksperimente uitgevoer in die temperatuurreeks van 20 tot 90 °C. Voordat die ensiem bygevoeg is en die reaksie begin is, is die buffer (0.1 M natriumsitraat, pH 4.5) en substraat (ABTS) gemeng en vir 5 minute by verskillende temperature geïnkubeer. Die termiese stabiliteit van die ensiem is bepaal deur inkubasie in 0.05 M natriumfosfaatbuffer (pH 7.0) by onderskeidelik 40, 50, 60 en 70 °C vir 2 uur. Residuele aktiwiteit is toe bepaal met behulp van die ABTS-substraat.
Die effek van pH op lakkase-aktiwiteit is bepaal deur ABTS as 'n substraat in 0.1 M sitraat-fosfaatbuffers met 'n pH-reeks van 2.5 tot 7.0 te gebruik. Die ensiemoplossing is vir twee uur by 40°C in 0.1 M sitraat- en Tris-buffers (pH 3, 4, 6 en 7) geïnkubeer om pH-stabiliteit te bepaal. Residuele aktiwiteit met ABTS as 'n substraat is na inkubasie bereken.
Die lakkase is vir 10 minute in natriumfosfaatbuffer (0.05 M, pH 7.0) geïnkubeer wat verskeie metaalione (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+, en Mn2+) bevat teen konsentrasies van onderskeidelik 2.5 mM en 10 mM. Die substraat (ABTS) is toe bygevoeg om die reaksie te begin, en die relatiewe aktiwiteit is bepaal.
ABTS-oksidasie deur lakkase teen verskillende konsentrasies (0.025–3 mM) is gemeet teen pH 4.5 om die kinetiese parameters (Vmax en Km) te bepaal. Die kinetiesekonstantesvan die Michaelis-Menten-vergelyking is bereken met behulp van 'n Lineweaver-Burk-grafiek, wat die omgekeerde van die reaksiespoed as 'n funksie van substraatkonsentrasie stip. Die kinetiese konstantes is bereken vanaf die Lineweaver-Burk-grafiek met behulp van GraphPad Prism weergawe 6.01 sagteware.
Nadat die appels deeglik met kraanwater gewas is, is hulle in die helfte gesny en met 'n voloutomatiese Braun MP80-appelsapmasjien (vervaardig in Duitsland) uitgepers. Die sap is deur vier lae kaasdoek gefiltreer. Geen ensieme is by die kontrolegroep gevoeg nie, terwyl 2.0% lakkase (die mees effektiewe konsentrasie wat getoets is) by vars voorbereide appelsap gevoeg is, wat toe vir twee weke by 4°C gestoor is.
Titreerbare suurheid (TA) en pH is bepaal volgens die metode van Boulton et.al.27Die pH van elke monster is gemeet met behulp van 'n digitale pH-meter (JENWAY 3510 pH-meter). Titreerbare suurheid (TA) is bereken op grond van appelsuur met behulp van die volgende formule.
Waar V en C onderskeidelik die volume (mL) en konsentrasie (0.1 mol/L) van die natriumhidroksiedoplossing is wat in die titrasie gebruik is. K is die appelsuur-omskakelingskoëffisiënt, gelyk aan 0.067, en W is die massa (g) van appelsap.
Die totale oplosbare vaste stowwe (TDS)-inhoud van alle sapmonsters is bepaal met behulp van 'n PAL-1 sakrefraktometer (ATAGO, Tokio, Japan). Na elke meting is die optiese lens met gedeïoniseerde water afgespoel, en elke appelsapmonster is drie keer getoets. Die waarde vir elke monster is bereken deur die gemiddelde van die drie metings te neem. Die gemiddelde ± standaardafwyking vir elke appelsapmonster is ook bereken deur die gemiddelde van hierdie resultate te neem.
Die viskoelastisiteit van die appelsapmonsters is bepaal met behulp van 'n rotasieviskometer (RV, Rheotest 2, Duitsland). Die monster is binne die "S2"-silinder van die viskometer geplaas. Skynbare viskositeit is voorgestel deur die helling van die skuifspanning teenoor skuiftempo-kurwe, wat bereken is uit die skuifspanning en die ooreenstemmende kurwes teen verskillende skuiftempo's (van 1.00 tot 437.4 s⁻¹). Die formule vir die berekening van skynbare viskositeit is soos volg:
Waar η die skynbare viskositeit (cP) is, τ die skuifspanning (dyn/cm²), γ die skuiftempo (sek⁻¹) is, en (τ) bereken word deur die wringkrag (α) en silinder (Z) waardes te gebruik met behulp van die volgende formule: τ = Z . α.
Die bruiningsindeks is bepaal volgens die metode van Meidav et.al.29'n Sapmonster van 10 ml is vir 10 minute by 2750 xg gesentrifugeer. 5 ml van die sapsupernatant is met 5 ml 95% etanol gemeng. Die absorbansie van die mengsel is by 420 nm gemeet met behulp van 'n Shimadzu UV-spektrofotometer (UV-1601 PC).
Totale fenoliese inhoud (TPC) is kolorimetries bepaal met behulp van die Folin-Ciocalteu-reagens soos beskryf deur Boulton et al.[27'n Standaardkurwe van gallussuur is gekonstrueer vir konsentrasies van 0 tot 500 mg/L (r²= 0.997). Resultate word uitgedruk as gallussuurekwivalente (mg GAE/mL).
Voeg 125 μL gedistilleerde water en 2850 μL FRAP-oplossing by 25 μL appelsap en laat die mengsel in die donker staan vir30min. Meet dan die absorbansie by 593 nm met behulp van 'n Shimadzu UV-spektrofotometer (UV-1601 PC). Die FRAP-reagens is voorberei deur 300 mM asetaatbuffer (pH 3.6), 20 mM yster(III)chloried en 10 mM 2,4,6-tris(2-piridiel)triasien (TPTZ) (opgelos in 40 mM HCl) in 'n verhouding van 10:1:1 te meng. 'n Standaardkurwe is gegenereer met behulp van Trolox as die standaard (R²= 0.999), en die resultate word uitgedruk as μM Trolox/mL.
Die antioksidantaktiwiteit van die behandelde en onbehandelde sappe is bepaal met behulp van die DPPH-metode om hul vermoë om DPPH-vrye radikale te verwyder, te evalueer.31Tien mikroliter sap is gemeng met 1 ml van 'n DPPH-oplossing (100 μM) in metanol. Na reaksie in die donker vir 30 minute, is die absorbansie van die mengsel gemeet by 517 nm met behulp van 'n Shimadzu UV-spektrofotometer (UV-1601 PC). Die resultate is uitgedruk as troloks-ekwivalente (μM troloks/ml) gebaseer op 'n kalibrasiekurwe (R2= 0.990).
Die verkrygde data het getoon dat maksimum lakkaseproduksie in NRC 620-oestersampioene teen die einde van die 18de dag van fermentasie waargeneem is, met 'n aktiwiteit van 1302 U/L. Dit het as basis gedien vir die bepaling van die optimale kweektyd vir lakkaseproduksie (Figuur 1). Alhoewel ensiemproduksie toegeneem het met toenemende kweektyd, was die tempo van toename nie direk eweredig aan die kweektyd nie; na 21 dae het die ensiemaktiwiteit met slegs 90 U/L (tot 1390 U/L) toegeneem. Daarom is 18 dae uiteindelik gekies as die optimale kweektyd om produkopbrengs te balanseer met die ekonomiese voordele van verhoogde kweektyd.
Effek van kweektyd op lakkase-opbrengs in Pleurotus ostreatus NRC 620. Drie (12 mm) swammiseliale blokke is in 50 ml steriele medium ingeënt en toe vir verskillende tye by 28 °C gekweek.
In ooreenstemming met ander studies, dui ons resultate daarop dat die ideale kweekperiode om piek lakkase-afskeiding deur swamme te bereik, waarskynlik tussen 7 en 36 dae is.32Volgens Ezike et al.33, *Trametes polyzona* WRF03 het die hoogste hoeveelheid lakkase teen die einde van die negende dag van fermentasie geproduseer, met 'n spesifieke aktiwiteit van 1637 U/mg proteïen. Verder het Othman et al.34het bevind dat *Trichoderma harzianum* S7113 'n groot hoeveelheid lakkase op die vyfde dag van kultuur afgeskei het. Die lakkase-produksietempo het 'n piekaktiwiteit op die veertiende dag bereik en toe geleidelik afgeneem.34Alhoewel ensiemsekresie ook tydens die hoofgroeifase kan plaasvind, bereik dit gewoonlik 'n piek tydens die intermediêre fase en word dit veroorsaak deur die verbruik van 'n koolstof- of stikstofbron.34,35
Alhoewel lakkase van Pleurotus ostreatus NRC 620 hoë aktiwiteit oor 'n wye temperatuurreeks van 50°C tot 80°C vertoon het, nader aan piekaktiwiteit (69–98%), is die maksimum aktiwiteit waargeneem by 70°C (Fig. 2a). Buite hierdie temperatuurreeks het ensiemaktiwiteit afgeneem teen ongeveer 70°C. Hierdie resultate dui daarop dat die ensiem aktief is by hoë temperature, waarskynlik omdat hoë temperatuur die kinetiese energie van die reaksie verhoog.
Effek van reaksietemperatuur (a) en pH (b) op lakkase-aktiwiteit in *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Temperature wat wissel van 20 tot 90 °C is bereik deur die mengsel by verskillende temperature vir 5 minute voor te inkubeer voordat die ensiem bygevoeg en die reaksie begin is. Die effek van pH op lakkase-aktiwiteit is geassesseer deur ABTS as 'n substraat te gebruik in oplossings wat 0.1 M sitraat-fosfaatbuffer bevat oor 'n pH-reeks van 2.5 tot 7.0.
Volgens Ezike et.al.33, die optimale temperatuur vir *Trametes polyzona* WRF03 lakkase is 55 °C, wat dieselfde is as dié vir *Ganoderma lucidum*laccase36en soortgelyk aan die optimale temperatuur (50 °C) vir *Trametes polyzona* KU-RNW02737lakkase . Baldrian38merk op dat, soos vir ander lignien-afbrekende ensiemstelsels, die ideale temperatuurreeks vir lakkase tussen 50 en 70 °C is.
Die resultate het getoon dat die ensiem die hoogste aktiwiteit by pH 3.0 vertoon het, en 94% aktiwiteit by pH 3.5 bereik het. Dit het egter aktief gebly oor 'n wye pH-reeks van 2.5 tot 7.0 (Figuur 2b). Verder het dit hoër aktiwiteit in suur toestande vertoon in vergelyking met neutrale of alkaliese toestande. Die aktiwiteit daarvan het ten minste 77% oor die pH-reeks van 2.5 tot 4.5 gebly, maar slegs ongeveer 38% by pH 7.0 bereik. Die optimale pH vir lakkase van *Trametes polyzona* WRF03 was 4.533, wat dieselfde is as die pH vir lakkases van *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40, en *Trametes hirsuta* 41. Volgens die studie deur Chairin et al.42, die optimale pH vir lakkase van *Polymorpha f. sp.* WR710-1 is 2.2, terwyl die optimale pH vir lakkase van *Polymorpha f. sp.* IBL-04 5.043 is. Die binding van hidroksiedanione (lakkase-inhibeerder) aan die koperatome van T2/T3-lakkase kan die rede wees vir die verminderde lakkase-aktiwiteit onder neutrale of alkaliese pH-toestande. Dit kan die interne elektronoordrag van die T1-sentrum na die T2/T3-sentrum ontwrig, waardeurbeperkenddie ensiemaktiwiteit23,44
Deur die ensiem by verskillende temperature te inkubeer, is gevind dat beide inkubasietyd en temperatuur die ensiemstabiliteit beïnvloed het. Dit is opmerklik dat lakkase van *Trametes polyzona* NRC 620 hoër stabiliteit by 40℃ en 50℃ vertoon het, met onderskeidelik 68.33% en 59.61% van sy aanvanklike aktiwiteit na 120 minute (Figuur 3a). In teenstelling hiermee, onder dieselfde toestande (40℃ en 50℃, 120 minute), het lakkase van *Trametes polyzona* WRF03 onderskeidelik 64.38% en 42.92% van sy aktiwiteit behou.33Inteendeel, toenemende inkubasietyd en temperatuur het die stabiliteit van *Trametes polyzona* NRC 620 lakkase verminder; Na inkubasie by 60℃ en 70℃ vir 60 minute, het die aktiwiteit daarvan afgeneem tot onderskeidelik 39.24% en 1.72% (Figuur 3a). In ooreenstemming met die eksperimentele resultate, het lakkase van *Trametes polyzona* WRF03 hoër stabiliteit by 40 en 50℃ getoon dwarsdeur die termiese behandelingsproses.33Net so, Lueangjaroenkit et al.al.37en Voorsitter et.al.42het die stabiliteit van lakkases van Trametes polyzona KURNW027 en Trametes polyzona WR710-1 by 50 °C vir onderskeidelik 1 uur gerapporteer. As 'n nuttige biokatalisator wat in verskeie biotegnologiese velde toepaslik is, behoort lakkase goeie stabiliteit en werkverrigting oor 'n wye temperatuurreeks te hê.
Termostatiese stabiliteit (a) en pH-stabiliteit (b) van lakkase van *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Termostatiese stabiliteit is bepaal deur die ensiemoplossing in 0.05 M natriumfosfaatbuffer (pH 7.0) by 40, 50, 60 en 70 °C vir onderskeidelik 2 uur te inkubeer. pH-stabiliteit is bepaal deur die ensiemoplossing in 0.1 M sitraatbuffer en Tris-buffer (pH 3, 4, 6 en 7) by 40 °C vir 2 uur te inkubeer. Residuele aktiwiteit is bereken met behulp van ABTS as 'n substraat na inkubasie.
Om die optimale toestande vir ensiemgebruik en -berging te bepaal, het ons die effek van pH op lakkase-stabiliteit ondersoek. Blootstelling aan verskillende pH-waardes het die stabiliteit van die proteïenstruktuur beduidend beïnvloed, en sodoende die stabiliteit en aktiwiteit van die ensiemolekule beïnvloed. Die resultate het getoon dat die ensiem minder stabiel was onder suur toestande, terwyl dit beter stabiliteit by hoër pH-waardes (neutrale en alkaliese streke) getoon het. By pH-waardes van 7.0, 6.0, 4.0 en 3.0 was die ensiemretensietempo's na 120 minute onderskeidelik ongeveer 100%, 62.54%, 52.39% en 11.14% (Fig. 3b). *Strombus multisus* WRF03-lakkase het hoër stabiliteit by neutrale pH-waardes (5.5–6.5) en laer stabiliteit by suur pH-waardes (onder 4.0) getoon. Na 120 minute by pH-waardes van 5.5, 6.0 en 6.5 was die ensiemretensietempo's onderskeidelik ongeveer 82%, 100% en 93%.33Khairin et al.42het opgemerk dat lakkase van Trametes polyzona WR710-1 stabiel was in die pH-reeks van 6.0 tot 7.0, terwyl Sayed et al.45het getoon dat lakkase meer stabiel was onder neutrale pH-toestande. Lakkase van Cerrena unicolor het egter ook stabiliteit onder alkaliese toestande (pH 9.0) getoon.46Die bestudeerde lakkases het hoë stabiliteit oor 'n wye pH-reeks getoon. Dit mag 'n belangrike eienskap vir industriële toepassings wees.
Aangesien sommige metaalione beide stimulerende en inhiberende effekte op ensiemaktiwiteit het, moet hul effekte op ensiemaktiwiteit in industriële toepassings in ag geneem word. Dit is van kritieke belang omdat metaalione algemene omgewingsbesoedelingstowwe is wat die stabiliteit en sintese van ekstrasellulêre ensieme kan beïnvloed.47Om die effekte van veelvuldige metaalione op lakkase van *Pleurotus ostreatus* NRC 620 te ondersoek, het ons ooreenstemmende eksperimente uitgevoer. Soos getoon in Figuur 4, afhangende van die tipe metaal wat gebruik word, het die verhoging van die metaalioonkonsentrasie van 2.5 mM tot 10 mM die ensiemfunksie negatief beïnvloed. Byvoorbeeld,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺, enCu²⁺kan die ensiemaktiwiteit stimuleer en aktiveer, terwylNa⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺, enK⁺kon die ensiemaktiwiteit inhibeer. Teen 'n konsentrasie van 10 mM was Cu²⁺- en Mg²⁺-ione die kragtigste aktiveerders van lakkase-aktiwiteit van *Pleurotus ostreatus* NRC 620, wat 'n aktiveringsgraad van onderskeidelik ongeveer 34% en 20% verskaf het. Teen 'n konsentrasie van 10 mM was Ca²⁺-ione egter die kragtigste inhibeerder van lakkase, wat ensiemaktiwiteit met ongeveer 60% verminder het.
Die effek van metaalione op die aktiwiteit van Pleurotus ostreatus NRC 620 lakkase. Die lakkase is vir 10 minute in natriumfosfaatbuffer (0.05 M, pH 7.0) geïnkubeer wat verskeie metaalione bevat teen konsentrasies van 2.5 mM en 10 mM. Die reaksie is toe geïnisieer deur die byvoeging van die substraat (ABTS), waarna die relatiewe aktiwiteit gemeet is.
Ons resultate stem ooreen met dié van ander outeurs wat bevind het dat Mg²⁺ en Cu²⁺ die aktiwiteit van *Trametes polyzona* WRF03³ verhoog. Castaño et al.⁴⁸ het bevind dat lakkase van *Xylaria* sp. tot 'n mate gestimuleer word deur koperione (Cu²⁺). Verder het Foroutanfar et al.⁴⁹ en Si et al.⁵⁰ soortgelyke studies uitgevoer oor lakkases van *Paraconiothyrium variabile* en *Trametes pubescens*, onderskeidelik. Die tipe II koperbindingsplek (T2) van hierdie ensiem kan versadig word met Cu²⁺ teen 'n gegewe konsentrasie, wat die stimulering van lakkase-aktiwiteit by hoër Cu²⁺³⁹-konsentrasies kan verklaar. Aangesien witvrot-swamme se lakkases oksidase is wat veelvuldige koperatome bevat, is die effekte van koperione op lakkase-aktiwiteit uiteenlopend en wissel van stimulerend en inhiberend tot neutraal.⁵¹ In teenstelling hiermee, Zhou et al.[52]het berig datCu²⁺het die lakkase-aktiwiteit van Taiwanese ondergrondse termiet (Odontotermes formosanus) geïnhibeer. Lakkases van Cerena sp. HYB07 het egter[53]en Clitocybe maxima[54]is nie deur koperione beïnvloed nie.
Die substraatspesifisiteit is verteenwoordig deur sy kinetiese parameters (Km en Vmax); hoe sterker die bindingsaffiniteit van die substraat aan die ensiem, hoe laer die Km-waarde en hoe hoër die substraatspesifisiteit.3,21,55Die kinetiese parameters (Km en Vmax) van lakkase van *Pleurotus ostreatus* NRC 620 is bepaal met behulp van GraphPad Prism 6.0 sagteware deur die Lineweaver-Burk plot te teken (Figuur 5). Wanneer ABTS as 'n substraat gebruik is, was die resultate 1.99 mM en 16217 μmol.min⁻¹ L⁻¹,onderskeidelik. Elsayed et al.21het berig dat die Km-waardes vir ABTS-oksidasie onderskeidelik 0.1 mM en 0.064 mM was, wat dui op 'n hoë affiniteit van Lac A- en Lac B-isoënsieme vir ABTS. Verder was die Vmax-waardes 0.182 μmol.min⁻¹en 0.603 μmolmin⁻¹, onderskeidelik. Die verkrygde Km-waarde was laer as dié van Trametes polyzona WRF03 (8.66 mM); verder was hul Vmax-waarde (1429 mmol min⁻¹) ooklaerwanneer ABTS as 'n substraat gebruik word.33 Net so was die Km-waardes van Lentinus squarrosulus MR13 en Trametes sp. AH28-2 lakkase-konsentrasies onderskeidelik 0.0714 mM en 0.025 mM, en die Vmax-waardes was 0.0091 mM min−1 en 0.67 mM min−1 mg−1 (relatief tot ABTS), onderskeidelik.56,57
Die effek van ABTS-konsentrasie op die aktiwiteit van lakkase van *Pleurotus ostreatus* NRC 620 is ondersoek, en 'n Lineweaver-Burk-grafiek van die omgekeerde van die aanvanklike reaksiesnelheid teenoor ABTS-konsentrasie is geplot. Die oksidasiereaksie van ABTS met verskillende konsentrasies (0.025–3.0 mM) lakkase is gemeet by pH 4.5 om die kinetiese parameters (Vmax en Km) te bepaal. Die Michaelis-Menten kinetiese konstantes is bereken met behulp van die Lineweaver-Burk-grafiek van die omgekeerde van die reaksiesnelheid teenoor die substraatkonsentrasie. Die kinetiese konstantes is bereken vanaf die Lineweaver-Burk-grafiek met behulp van GraphPad Prism 6.01 sagteware.
Tradisionele verhelderende ensieme, soos pektinases, hidroliseer pektienstowwe, wat viskositeit en troebelheid verminder. Hulle breek strukturele polisakkariede effektief af en word dikwels in kombinasie met ander ensieme, soos sellulases en hemisellulases, gebruik om opbrengs en helderheid te verbeter. Pektinases teiken egter nie spesifiek fenoliese verbindings nie, wat die hoofbydraers tot troebelheid en oksidatiewe verbruining is, veral in sappe soos appel- en druiwesap.58In teenstelling hiermee kataliseer lakkases die oksidasie van fenoliese verbindings deur hulle te polimeer in groter, onoplosbare molekules wat deur sedimentasie of filtrasie verwyder kan word. Hierdie meganisme verbeter nie net die helderheid nie, maar verleng ook die rakleeftyd van sap deur die waarskynlikheid van oksidatiewe verbruining wat deur fenoliese verbindings veroorsaak word, te verminder. Verder kan lakkase-gebaseerde verhelderingsprosesse onder matige verwerkingstoestande (pH 3.5–5.5, temperatuur 25–40 °C) uitgevoer word, wat hulle geskik maak vir delikate sappe sonder om hul voedings- of organoleptiese eienskappe in die gedrang te bring.59Studies het getoon dat pektinasebehandeling sap binne 1-2 uur kan verhelder, terwyl lakkasebehandeling tipies 'n langer reaksietyd (3-6 uur) vereis om fenoliese verbindings heeltemal te verminder. Hierdie proses kan egter geoptimaliseer word deur die ensiem te immobiliseer of deur lakkase met meganiese verhelderingsmetodes te kombineer.60In hierdie studie het ensiemprofilering van die ru-ekstrak beduidende lakkase- en α-amilase-aktiwiteite getoon, terwyl pektinase- en xilanase-aktiwiteite uiters laag was, en sellulase-aktiwiteit nie waargeneem is nie. Daarom was die vermindering in troebelheid en fenoliese inhoud hoofsaaklik te wyte aan die werking van lakkase, terwyl die verandering in viskositeit gedeeltelik te wyte kan wees aan die werking van amilase.
Tabel 1 toon die fisies-chemiese parameters van varsgeperste appelsap en lakkase-behandelde monsters. Die resultate het getoon dat die opbrengs van varsgeperste appelsap (71.59%) laer was as dié van lakkase-behandelde monsters (87.34%). Hierdie resultate stem ooreen met die bevindinge van Pilnik en Orange.61, wat aangedui het dat die gebruik van ensieme in vrugteverwerking die sapopbrengs kan verhoog, filtrasie kan verbeter en hoëgehalte, helder sap vir konsentrasie kan verkry. Die toename in sapopbrengs is hoofsaaklik te wyte aan die toename in die inhoud van oplosbare suikers in die sap. Tydens ensiematiese hidrolise van vrugte word mesoglea en pektien in die selwande van die produk vernietig en omgeskakel in oplosbare stowwe soos neutrale suikers en sure.62.Die pH-waarde van die ensiembehandelde appelsap was beduidend laer as dié van die kontrolegroep (P < 0.05), en die pH-waarde van beide groepe het beduidend toegeneem tydens berging (Tabel 1). Hierdie resultate stem ooreen met dié van Mark et al.63, wat opgemerk het dat die pH van kasjoeneutvrugtesap na berging na hittebehandeling afgeneem het. Pektien-afbraak en galakturoonsuurvorming na ensiembehandeling kan verantwoordelik wees vir die toename in pH tydens berging. Die pH van ensiembehandelde monsters het dwarsdeur berging tussen 4.05 en 4.31 gebly, terwyl die pH van onbehandelde appelsap tussen 4.12 en 4.33 gewissel het.
Die totale suurheid (TA) van beide onbehandelde en lakkase-behandelde monsters het 'n afnemende neiging getoon met toenemende bergingstyd (Tabel 1). Die afname in suurheid is toegeskryf aan die omskakeling van organiese sure na koolhidrate of ensiematiese reaksies, sowel as oksidasie tydens sapberging.64Die totale suurheid van die kontrole-appelsap en ensiembehandelde monsters was laer as dié van ander sappe (aarbei-sap 0.9%, pruim-sap 2.2%, koemkwatsap 1.0%, appelkoos-sap 2.4%, lemoensap 0.8%), maar soortgelyk aan dié van ander sappe (bv. peersap 0.3%).62Hierdie verskille in onbehandelde varsgeperste appelsap kan te wyte wees aan verskeie faktore soos groeitoestande, genetiese faktore, volwassenheidsvlak en verwerkingsmetodes.65Die afname in totale suurheid van die kontrole- en lakkase-behandelde appelsap stem ooreen met die resultate wat deur Singh et al. aangebied is.66rakende die afname in totale suurheid van Jin Nuo-appelsap na 74 dae se berging. Aan die ander kant, Oshmiansky en Wojdylo67het geen beduidende veranderinge in die suurheid van appelsap gevind toe die effek van tradisionele verhelderingsmetodes bestudeer is nie.
Die resultate wat in Tabel 1 aangebied word, dui daarop dat die totale oplosbare vastestowwe (TSS) waarde van die lakkase-behandelde appelsap hoër was as dié van die onbehandelde monster. Hierdie resultate stem ooreen met die gepubliseerde studies.. 68Verder toon Tabel 1 dat die TSS-waarde van die kontrole-appelsapgroep 9.58 was op die aanvanklike tydstip en 11.05 bereik het teen die einde van die bergingstydperk. Hierdie waardes is laer as die TSS-waardes van vars appelsap wat deur Hamid et al. gerapporteer is.. 69(onderskeidelik 11.2 en 11.80). Die TSS-waarde van die lakkase-behandelde appelsapmonsters het beduidend toegeneem, beginnende vanaf 11.23 en bereik 12.93 na twee weke se berging by 4°C (Tabel 1). 'n Soortgelyke toename in TSS tydens berging is ook waargeneem in sitrusvrugte, suurlemoene en soet lemoene. Die toename in totale oplosbare vaste stowwe (TSS) tydens berging kan wees as gevolg van die hidrolise van polisakkariede (stysel) na monosakkariede (suikers), die toename in konsentrasie as gevolg van sapdehidrasie, en die afbraak van pektien in die sap na oplosbare vaste stowwe. Die toename in totale oplosbare vaste stowwe (TSS) is waarskynlik te wyte aan die toename in oplosbare suikers, wat gevorm kan word deur die omskakeling van pektien of sellulose na oplosbare suikers deur onderskeidelik pektien of sellulase, of deur die hidrolise van stysel na suikers, soos gerapporteer deur Hamed et al.69.Die effek van lakkase op die eienskappe van appelsap kan visueel waargeneem word, aangesien lakkase-behandelde appelsap beter vloeibaarheid en laer viskositeit toon as onbehandelde sap. Hierdie waarneming word in Tabel 1 aangeteken; Die viskositeit van die ensiembehandelde monster was 1.87 cP, terwyl die viskositeit van die kontrolemonster 2.95 cP was. Hierdie beduidende afname in viskositeit is waarskynlik te wyte aan die hoër waterhouvermoë van pektienagtige stowwe en die vorming van 'n samehangende netwerkstruktuur.
In hierdie studie is die effek van lakkase op die verbruiningsindeks (BI) van appelsap ondersoek deur die absorbansie by 420 nm met behulp van 'n spektrofotometer te meet. Die resultate word in Tabel 1 getoon. Tydens berging het die BI van appelsapmonsters in beide die behandelde en onbehandelde groepe 'n geleidelike toenemende neiging getoon. BI weerspieël die mate van verbruining en kan dien as'n belangrikeaanduiding van ensiematiese en nie-ensiematiese bruiningsreaksies. Die absorbansie het beduidend toegeneem tydens berging (P < 0.05). Aan die einde van berging, dieA420Die waarde van appelsapmonsters in die kontrole- en ensiembehandelde groepe het onderskeidelik met ongeveer 217% en 121% toegeneem (Tabel 1). Die resultate dui daarop dat ensiembehandeling die verbruiningsgraad effektief met ongeveer 56% kan verminder. Die resultate van Bezerra et al.[19] stem ooreen met ons resultate; Hulle het lakkase-glutaraldehied-klappervesel gebruik om appelsap te verhelder, wat die oorspronklike kleur met 61% verminder het.
Alhoewel polifenole in vrugtesappe positiewe voedings- en terapeutiese effekte op die menslike liggaam het, kan hulle ook met proteïene reageer, wat saptroebelheid, sedimentasie of troebelheid veroorsaak, waardeur die geur en aroma van die produk verander en die rakleeftyd daarvan verminder word.71Die doel van hierdie studie was om die fenoliese verbindinginhoud van appelsap veilig te verminder deur lakkase van Pleurotus ostreatus NRC 620 te gebruik. Die resultate wat in Tabel 1 aangebied word, toon dat die totale fenoliese verbindinginhoud van lakkase-behandelde appelsap aansienlik verminder is voor berging by 4 °C. Verder het die totale fenoliese verbindinginhoud ook tydens berging in beide bestudeerde monsters afgeneem (Tabel 1). Navorsing deur Sandri et al.72het getoon dat ensiembehandelde appelsap sy antioksidantaktiwiteit en fenoliese verbindinginhoud kan behou. Die resultate van 'n studie deur Lettera et al.73toon dat behandeling van lemoensap met swamlakkase die inhoud van fenoliese verbindings daarin met tot 45% kan verminder.
Fenoliese verbindings het getoon dat hulle eienskappe soos vrye radikale afvang, enkelvoudige suurstofreduksie en -blus, waterstofatoomoordrag en elektronskenking aan vrye radikale het, wat hulle kragtige antioksidante maak.74Daarom is DPPH- en FRAP-gebaseerde metodes in hierdie studie gebruik om die effek van lakkase op die antioksidantaktiwiteit van appelsap wat vir 14 dae in 'n yskas gestoor is, te evalueer (Tabel 2). Beide metodes het 'n toename in antioksidantaktiwiteit tydens berging getoon, wat moontlik te wyte is aan die toename in vrye fenoliese verbindings of die vorming van Maillard-reaksieprodukte (MRP's), met Maillard-reaksieprodukte waarskynlik die oorsaak van die toename in antioksidantaktiwiteit.75Nie-ensiematiese verbruiningsreaksies (insluitend askorbiensuur-afbraak, Maillard-reaksies en suurgekataliseerde afbraak van suikers) produseer bruin pigmente (melanoïdiene). Intermediêre askorbiensuur-afbraakprodukte en suiker-afbraakprodukte (soos karbonielverbindings) kan met aminosure reageer deur Maillard-reaksies.76Alhoewel die verbruining van vrugte en groente tydens berging breedvoerig bestudeer is, bly ons begrip van hierdie reaksies beperk.77In vergelyking met die FRAP-metode, het lakkase-behandelde appelsap beduidend laer antioksidantaktiwiteit getoon deur die DPPH-metode (Tabel 2), en die antioksidantaktiwiteit van alle monsters het beduidend toegeneem met toenemende bergingstyd. Twee verskillende metodes vir die bepaling van antioksidantaktiwiteit is in hierdie studie gebruik omdat hul beginsels verskil. Die DPPH-metode meet die vermoë om vrye radikale te neutraliseer, terwyl die FRAP-metode die vermoë meet om ysterione te verminder. Daarom word dit aanbeveel om verskeie metodes te gebruik vir die bepaling van antioksidantaktiwiteit om die antioksidantaktiwiteit van die bestudeerde monsters beter te verstaan.78
Een van die belangrikste bevindinge van hierdie studie is dat *Pleurotus ostreatus* lakkase NRC 620 optimale aktiwiteit toon by 70°C en pH 3.0. In vergelyking met ander swamlakkases wat algemeen vir sapverheldering gebruik word, soos *Trametes versicolor* en *Ganoderma lucidum* lakkases, toon *P. ostreatus* NRC 620 hoër termiese stabiliteit en 'n meer suur pH. Lakkases van *Trametes versicolor* en *Ganoderma lucidum* toon tipies optimale aktiwiteit in die reeks van 50-60°C en by pH-waardes tussen 3.5 en 5.0. Hierdie verskil kan bydra tot verbeterde sapverhelderingsdoeltreffendheid, veral vir suur sappe waar stabiliteit by laer pH-waardes krities is. Die unieke eienskap van *P. In vergelyking met ander bestudeerde swamlakkases, toon *Pleurotus ostreatus* NRC 620 die vermoë om effektief onder meer uitdagende toestande te funksioneer. Die hoër optimale aktiwiteitstemperatuur dui op potensiële voordele in industriële toepassings, soos vinniger reaksiesnelhede en verminderde mikrobiese kontaminasie. Die lae pH, wat goed geskik is vir die suur aard van baie sappe, kan nuttig wees in sapverhelderingsprosesse. Hierdie resultate regverdig verdere ondersoek vir grootskaalse toepassing, wat *Pleurotus ostreatus* NRC 620 'n lewensvatbare alternatief vir tradisionele swamlakkasebronne maak. In vergelyking met vorige studies het ons gevind dat die optimale temperatuur 60°C en die optimale pH 3.0 is. Na reaksie by 60°C vir 80 minute het *Ganoderma lucidum*-lakkase behoue gebly.46% van sy aktiwiteit.79 Volgens Kurniawati en Nicelle80, *Ganoderma lucidum* ensieme vertoon uitstekende tot matige stabiliteit by 25°C en pH-waardes wat wissel van 5.0 tot 8.0, en stabiliteit by pH 6.0 en temperature wat wissel van 10 tot 30°C. In hierdie studie het ons gevind dat die optimale pH en temperatuur vir ensiemaktiwiteit vir *Pleurotus ostreatus* onderskeidelik 3.0 en 70°C was. Na inkubasie by 40°C en 50°C vir twee uur, het die ensiem onderskeidelik 68.33% en 59.61% van sy aktiwiteit behou. Verder het Pleurotus ostreatus NRC 620 lakkase hoë aktiwiteit oor 'n wye temperatuurreeks van 50°C tot 80°C vertoon, en byna maksimum aktiwiteit (69%–98%) bereik, met maksimum aktiwiteit waargeneem by 70°C.
Ten slotte het oestersampioenlakkase NRC620, verkry onder statiese toestande, optimale aktiwiteit en stabiliteit oor 'n reeks pH- en temperatuurtoestande getoon, wat beter stabiliteit in vergelyking met ander ensiembronne toon. Die byvoeging van 10 mM MgSO₄ en CuSO₄ het ensiemaktiwiteit met onderskeidelik ongeveer 21% en 35% verhoog. Wanneer dit in appelsap verwerk is, het die ensiem die pH en viskositeit verminder, terwyl die fenoliese inhoud slegs effens afgeneem het tydens berging.
Die resultate bevestig die potensiaal van lakkase in die voedselbedryf, veral in drankverheldering. Deur spesifiek fenoliese verbindings af te breek, verminder lakkase nie net troebelheid en verbeter dit die helderheid nie, maar handhaaf ook die kwaliteit van vrugtesappe onder matige bedryfstoestande. Anders as tradisionele verhelderingsmiddels soos gelatien, bentoniet en silikagel, genereer lakkase geen afval of verwyder aangename aromas uit drankies nie, wat dit 'n meer omgewingsvriendelike en volhoubare opsie maak. Verder, in vergelyking met ander ensieme en filtrasiemetodes, bied lakkase 'n geteikende en koste-effektiewe oplossing sonder om produkgehalte in te boet.
Kyomuhimbo, HD en Brink, HG. Toepassings en immobiliseringsstrategieë van koperbevattende lakkases; 'n oorsig. Heliyon 9, e13156 (2023).
Plasingstyd: 15 Desember 2025